文章來源：半夏 藥靶孺子牛
絕經后骨質疏松癥（PMOP）是由于卵巢功能衰竭導致雌激素流失引起，成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收導致的骨穩態不平衡被認為是骨質疏松癥的主要原因。盡管臨床上有多種藥物可用于骨質疏松癥治療，但嚴重的副作用限制了其進一步的推廣和應用。具有納米級膜結構的細胞衍生納米囊泡（NV）通過運輸生物信息，包括核酸、蛋白質、脂質和代謝物，調節生物體的生物學功能。中草藥來源的細胞外囊泡樣納米顆粒具有多種優勢，包括生物相容性、成本效益、生態友好性并可大規模生產。
骨碎補（Rhizoma Drynariae）是一種具有補腎強骨功效的中草藥，常用于臨床治療骨相關疾病。然而，中藥有效成分在體內溶解性差、分布不均等問題亟待解決，此外，骨碎補在抗骨質疏松癥中的有效成分及其功能仍不清楚。新鮮草藥衍生的NVs已被研究為天然活性成分的合適載體，作者推測骨碎補衍生的納米囊泡（RDNV）富含特定的生物功能分子，可以用作合適的治療納米平臺。
2024年2月10日，廣州中醫藥大學趙可偉、南方醫科大學鄭磊、南京中醫藥大學喬宏志團隊合作在Acta Pharm Sin B（IF=14.8）發表了題為“Rhizoma Drynariae-derived nanovesicles reverse osteoporosis by potentiating osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells via targeting ERα signaling”的文章，揭示新鮮草藥骨碎補中分離的納米囊泡（RDNV）對絕經后骨質疏松癥的治療潛力，并證明RDNV通過靶向ERα增強人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）的增殖和成骨分化。此外，RDNV中的柚皮苷是成骨作用中靶向ER α的活性成分。
在這項研究中，作者證明從新鮮草藥骨碎補（Rhizoma Drynariae）中分離的納米囊泡（RDNV）是一種活性ERα激動劑，RDNVs通過誘導hBMSC成骨分化和骨形成對絕經后骨質疏松癥（PMOP）具有有效的治療作用。此外，RDNVs靶向股骨組織但沒有器官毒性。重要的是，通過高效液相色譜（HPLC）驗證和生物信息學分析，發現柚皮苷（naringin）是RDNV的一種生物活性物質，它通過激活hBMSC中ER α信號傳導促進BMP2和RUNX2表達，促進成骨細胞形成（圖1）。
圖1 RDNV靶向ERα信號傳導增強hBMSC成骨分化來逆轉骨質疏松
1、RDNVs的物理化學表征
作者通過差速離心從新鮮的碎骨補中獲得和純化RDNV，并通過透射電子顯微鏡（TEM）、Flow NanoAnalyzer、Nanoview進行了表征，且不同的pH條件下，RDNVs粒徑和濃度穩定。因此，可以從天然中藥碎骨補中分離出穩定、可靠和豐富的RDNV（圖2A-D）。
接著，作者分別通過瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和TLC發現RDNVs中存在RNA、蛋白質和脂質，表明RDNV可能在細胞間信號傳導中發揮作用，并通過蛋白質、RNA和脂質發揮廣泛的生物學功能（圖2E-G）。
采用中藥特色圖譜技術對藥材質量進行評價，具有良好的穩定性和準確性。為了確定獲得的RDNVs是否與碎骨補共享特征圖譜，作者采用高效液相色譜（HPLC）發現柚皮苷（naringin）存在于RDNV中，且不同批次RDNV中柚皮苷的濃度是穩定的（圖2H-I）。
圖2?RDNV的鑒定和物理化學表征
3、RDNV在體內是骨靶向的
為了確定RDNV在體內的分布，DiR標記的RDNV通過靜脈注射和腹腔注射給予雌性C57BL/6J小鼠。結果顯示在靜脈注射和腹腔注射后48h發現了股骨中RDNV的最大富集量。此外，在肝臟中觀察到大量RDNV，在脾臟和肺中的存在較少。
接著，作者分離了雌性C57BL/6J小鼠股骨的小鼠骨髓間充質干細胞（mBMSCs），分析DiI標記的RDNVs標記mBMSCs的效率，發現mBMSCs體內DiI標記的RDNVs攝取陽性率在48小時可達>35%，結果表明RDNVs在體內被股骨中的BMSC吸收（圖3）。
圖3 RDNV在體內的生物分布
4、RDNV減輕體內骨質流失
為了評估RDNVs對PMOP的治療效果，作者建立了卵巢切除（OVX）小鼠模型，腹腔注射RDNVs。結果顯示RDNV逆轉了骨質疏松癥引起的骨鈣缺乏和股骨堿性磷酸酶（ALP）升高，表明 RDNVs可以有效緩解體內骨質流失，從而預防或逆轉骨質疏松癥。此外，生物相容性分析顯示RDNVs沒有明顯組織損傷和肝腎功能相關血清學參數異常（圖4）。
圖4 RDNV改善卵巢切除術誘導的體內骨質流失
5、RDNV可在體外被hBMSCs攝取
作者獲得了原代hBMSCs，發現親脂性熒光染料 DiI 標記的RDNV被hBMSC內化，主要分布在細胞核周圍的細胞質中，在48小時可更有效地被hBMSCs內化。此外，四種內吞作用抑制劑可以顯著抑制RDNV的內吞作用，表明小窩介導的內吞作用參與RDNV的細胞攝取（圖5）。
圖5 RDNV可在體外被hBMSCs攝取
6、RDNV在體外促進hBMSC增殖和分化
接著，作者發現RDNVs顯示出顯著的hBMSCs促增殖能力，且對hBMSCs細胞凋亡無影響。因為類黃酮與雌激素結構相似且碎骨補具有類似植物雌激素的作用。作者推測RDNV可能會充當ERα激動劑以激活雌激素途徑。結果顯示RDNV在hBMSC增殖過程中時間依賴性地增強了ERα mRNA表達水平。此外，茜素紅染色等實驗發現RDNV可以像雌激素一樣誘導成骨分化。機制上，RDNV激活ERα信號促進BMP2和RUNX2表達，激活BMP/Smad通路（圖6）。
圖6 RDNV在體外促進hBMSC增殖和分化
7、RDNVs有效成分靶向ERα信號傳導
為了進一步驗證RDNVs有效成分及可能機制，作者對RDNVs進行了成分分析，共鑒定了3075種物質。據報道，黃酮類化合物如槲皮素、淫羊藿苷和柚皮苷與促成骨特性和骨形成顯著相關。因此，作者專注于RDNVs中的黃酮類化合物。將RDNVs中所含的成分與碎骨補中的115 種活性成分取交集，發現11種交叉成分，其中柚皮苷含量最高。
將碎骨補的115種成分的靶基因與4957個骨質疏松癥相關基因取交集得到的77個基因開展KEGG分析，雌激素信號通路顯著富集，且RDNV和碎骨補中共有的11種成分中大多數與骨質疏松癥的核心信號靶標有關，PPI網絡顯示ESR1（ERα）是參與骨質疏松癥信號通路的最重要蛋白質之一。將11種成分與Erα進行分子對接發現柚皮苷與Erα具有穩定的結合，通過表面等離子體共振（SPR）和藥物親和反應靶點穩定性（DARTS）證實柚皮苷與ER α的直接結合。因此，ERα被認為是柚皮苷的結合靶點（圖7）。
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圖7 RDNVs有效成分靶向ERα信號傳導
總結
從新鮮草藥骨碎補（Rhizoma Drynariae）中分離的納米囊泡（RDNV）在卵巢切除小鼠模型中表現出有效的骨組織靶向活性和抗骨質疏松癥功效。RDNVs 被 hBMSCs 有效內化，增強 hBMSC 的增殖和 ERα表達水平，促進成骨分化和骨形成。從機制上講，通過 ERα 信號通路，RDNV 促進了 hBMSC 中BMP2和RUNX2表達的 mRNA 和蛋白表達，這些蛋白參與調節成骨分化。進一步分析顯示，存在于 RDNV 中的柚皮苷是成骨效應中靶向 ERα 的活性成分。
參考文獻
Zhao Q, Feng J, Liu F, Liang Q, Xie M,
Dong J, Zou Y, Ye J, Liu G, Cao Y, Guo Z, Qiao H, Zheng L, Zhao K. Rhizoma
Drynariae-derived nanovesicles reverse osteoporosis by potentiating osteogenic
differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells via targeting ERα
signaling. Acta Pharm Sin B. 2024 May;14(5):2210-2227. doi:
10.1016/j.apsb.2024.02.005. Epub 2024 Feb 10. PMID: 38799625; PMCID:
PMC11119514.
