文章來源：半夏 藥靶孺子牛
絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP）是由于卵巢功能衰竭導(dǎo)致雌激素流失引起，成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收導(dǎo)致的骨穩(wěn)態(tài)不平衡被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松癥的主要原因。盡管臨床上有多種藥物可用于骨質(zhì)疏松癥治療，但嚴(yán)重的副作用限制了其進(jìn)一步的推廣和應(yīng)用。具有納米級(jí)膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞衍生納米囊泡（NV）通過運(yùn)輸生物信息，包括核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和代謝物，調(diào)節(jié)生物體的生物學(xué)功能。中草藥來源的細(xì)胞外囊泡樣納米顆粒具有多種優(yōu)勢(shì)，包括生物相容性、成本效益、生態(tài)友好性并可大規(guī)模生產(chǎn)。
骨碎補(bǔ)（Rhizoma Drynariae）是一種具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨功效的中草藥，常用于臨床治療骨相關(guān)疾病。然而，中藥有效成分在體內(nèi)溶解性差、分布不均等問題亟待解決，此外，骨碎補(bǔ)在抗骨質(zhì)疏松癥中的有效成分及其功能仍不清楚。新鮮草藥衍生的NVs已被研究為天然活性成分的合適載體，作者推測(cè)骨碎補(bǔ)衍生的納米囊泡（RDNV）富含特定的生物功能分子，可以用作合適的治療納米平臺(tái)。
2024年2月10日，廣州中醫(yī)藥大學(xué)趙可偉、南方醫(yī)科大學(xué)鄭磊、南京中醫(yī)藥大學(xué)喬宏志團(tuán)隊(duì)合作在Acta Pharm Sin B（IF=14.8）發(fā)表了題為“Rhizoma Drynariae-derived nanovesicles reverse osteoporosis by potentiating osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells via targeting ERα signaling”的文章，揭示新鮮草藥骨碎補(bǔ)中分離的納米囊泡（RDNV）對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療潛力，并證明RDNV通過靶向ERα增強(qiáng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）的增殖和成骨分化。此外，RDNV中的柚皮苷是成骨作用中靶向ER α的活性成分。
在這項(xiàng)研究中，作者證明從新鮮草藥骨碎補(bǔ)（Rhizoma Drynariae）中分離的納米囊泡（RDNV）是一種活性ERα激動(dòng)劑，RDNVs通過誘導(dǎo)hBMSC成骨分化和骨形成對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP）具有有效的治療作用。此外，RDNVs靶向股骨組織但沒有器官毒性。重要的是，通過高效液相色譜（HPLC）驗(yàn)證和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)柚皮苷（naringin）是RDNV的一種生物活性物質(zhì)，它通過激活hBMSC中ER α信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)BMP2和RUNX2表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞形成（圖1）。
圖1 RDNV靶向ERα信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)hBMSC成骨分化來逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松
1、RDNVs的物理化學(xué)表征
作者通過差速離心從新鮮的碎骨補(bǔ)中獲得和純化RDNV，并通過透射電子顯微鏡（TEM）、Flow NanoAnalyzer、Nanoview進(jìn)行了表征，且不同的pH條件下，RDNVs粒徑和濃度穩(wěn)定。因此，可以從天然中藥碎骨補(bǔ)中分離出穩(wěn)定、可靠和豐富的RDNV（圖2A-D）。
接著，作者分別通過瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和TLC發(fā)現(xiàn)RDNVs中存在RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，表明RDNV可能在細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用，并通過蛋白質(zhì)、RNA和脂質(zhì)發(fā)揮廣泛的生物學(xué)功能（圖2E-G）。
采用中藥特色圖譜技術(shù)對(duì)藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，具有良好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。為了確定獲得的RDNVs是否與碎骨補(bǔ)共享特征圖譜，作者采用高效液相色譜（HPLC）發(fā)現(xiàn)柚皮苷（naringin）存在于RDNV中，且不同批次RDNV中柚皮苷的濃度是穩(wěn)定的（圖2H-I）。
圖2?RDNV的鑒定和物理化學(xué)表征
3、RDNV在體內(nèi)是骨靶向的
為了確定RDNV在體內(nèi)的分布，DiR標(biāo)記的RDNV通過靜脈注射和腹腔注射給予雌性C57BL/6J小鼠。結(jié)果顯示在靜脈注射和腹腔注射后48h發(fā)現(xiàn)了股骨中RDNV的最大富集量。此外，在肝臟中觀察到大量RDNV，在脾臟和肺中的存在較少。
接著，作者分離了雌性C57BL/6J小鼠股骨的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mBMSCs），分析DiI標(biāo)記的RDNVs標(biāo)記mBMSCs的效率，發(fā)現(xiàn)mBMSCs體內(nèi)DiI標(biāo)記的RDNVs攝取陽性率在48小時(shí)可達(dá)>35%，結(jié)果表明RDNVs在體內(nèi)被股骨中的BMSC吸收（圖3）。
圖3 RDNV在體內(nèi)的生物分布
4、RDNV減輕體內(nèi)骨質(zhì)流失
為了評(píng)估RDNVs對(duì)PMOP的治療效果，作者建立了卵巢切除（OVX）小鼠模型，腹腔注射RDNVs。結(jié)果顯示RDNV逆轉(zhuǎn)了骨質(zhì)疏松癥引起的骨鈣缺乏和股骨堿性磷酸酶（ALP）升高，表明 RDNVs可以有效緩解體內(nèi)骨質(zhì)流失，從而預(yù)防或逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松癥。此外，生物相容性分析顯示RDNVs沒有明顯組織損傷和肝腎功能相關(guān)血清學(xué)參數(shù)異常（圖4）。
圖4 RDNV改善卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的體內(nèi)骨質(zhì)流失
5、RDNV可在體外被hBMSCs攝取
作者獲得了原代hBMSCs，發(fā)現(xiàn)親脂性熒光染料 DiI 標(biāo)記的RDNV被hBMSC內(nèi)化，主要分布在細(xì)胞核周圍的細(xì)胞質(zhì)中，在48小時(shí)可更有效地被hBMSCs內(nèi)化。此外，四種內(nèi)吞作用抑制劑可以顯著抑制RDNV的內(nèi)吞作用，表明小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用參與RDNV的細(xì)胞攝取（圖5）。
圖5 RDNV可在體外被hBMSCs攝取
6、RDNV在體外促進(jìn)hBMSC增殖和分化
接著，作者發(fā)現(xiàn)RDNVs顯示出顯著的hBMSCs促增殖能力，且對(duì)hBMSCs細(xì)胞凋亡無影響。因?yàn)轭慄S酮與雌激素結(jié)構(gòu)相似且碎骨補(bǔ)具有類似植物雌激素的作用。作者推測(cè)RDNV可能會(huì)充當(dāng)ERα激動(dòng)劑以激活雌激素途徑。結(jié)果顯示RDNV在hBMSC增殖過程中時(shí)間依賴性地增強(qiáng)了ERα mRNA表達(dá)水平。此外，茜素紅染色等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RDNV可以像雌激素一樣誘導(dǎo)成骨分化。機(jī)制上，RDNV激活ERα信號(hào)促進(jìn)BMP2和RUNX2表達(dá)，激活BMP/Smad通路（圖6）。
圖6 RDNV在體外促進(jìn)hBMSC增殖和分化
7、RDNVs有效成分靶向ERα信號(hào)傳導(dǎo)
為了進(jìn)一步驗(yàn)證RDNVs有效成分及可能機(jī)制，作者對(duì)RDNVs進(jìn)行了成分分析，共鑒定了3075種物質(zhì)。據(jù)報(bào)道，黃酮類化合物如槲皮素、淫羊藿苷和柚皮苷與促成骨特性和骨形成顯著相關(guān)。因此，作者專注于RDNVs中的黃酮類化合物。將RDNVs中所含的成分與碎骨補(bǔ)中的115 種活性成分取交集，發(fā)現(xiàn)11種交叉成分，其中柚皮苷含量最高。
將碎骨補(bǔ)的115種成分的靶基因與4957個(gè)骨質(zhì)疏松癥相關(guān)基因取交集得到的77個(gè)基因開展KEGG分析，雌激素信號(hào)通路顯著富集，且RDNV和碎骨補(bǔ)中共有的11種成分中大多數(shù)與骨質(zhì)疏松癥的核心信號(hào)靶標(biāo)有關(guān)，PPI網(wǎng)絡(luò)顯示ESR1（ERα）是參與骨質(zhì)疏松癥信號(hào)通路的最重要蛋白質(zhì)之一。將11種成分與Erα進(jìn)行分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)柚皮苷與Erα具有穩(wěn)定的結(jié)合，通過表面等離子體共振（SPR）和藥物親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性（DARTS）證實(shí)柚皮苷與ER α的直接結(jié)合。因此，ERα被認(rèn)為是柚皮苷的結(jié)合靶點(diǎn)（圖7）。
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圖7 RDNVs有效成分靶向ERα信號(hào)傳導(dǎo)
總結(jié)
從新鮮草藥骨碎補(bǔ)（Rhizoma Drynariae）中分離的納米囊泡（RDNV）在卵巢切除小鼠模型中表現(xiàn)出有效的骨組織靶向活性和抗骨質(zhì)疏松癥功效。RDNVs 被 hBMSCs 有效內(nèi)化，增強(qiáng) hBMSC 的增殖和 ERα表達(dá)水平，促進(jìn)成骨分化和骨形成。從機(jī)制上講，通過 ERα 信號(hào)通路，RDNV 促進(jìn)了 hBMSC 中BMP2和RUNX2表達(dá)的 mRNA 和蛋白表達(dá)，這些蛋白參與調(diào)節(jié)成骨分化。進(jìn)一步分析顯示，存在于 RDNV 中的柚皮苷是成骨效應(yīng)中靶向 ERα 的活性成分。
參考文獻(xiàn)
Zhao Q, Feng J, Liu F, Liang Q, Xie M,
Dong J, Zou Y, Ye J, Liu G, Cao Y, Guo Z, Qiao H, Zheng L, Zhao K. Rhizoma
Drynariae-derived nanovesicles reverse osteoporosis by potentiating osteogenic
differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells via targeting ERα
signaling. Acta Pharm Sin B. 2024 May;14(5):2210-2227. doi:
10.1016/j.apsb.2024.02.005. Epub 2024 Feb 10. PMID: 38799625; PMCID:
PMC11119514.
