文章來源：中草藥雜志社
? ? ? ? 尿酸（uric acid，UA）水平過高會增加痛風、腎病及心血管疾病風險[1-3]。高尿酸血癥的治療通常依賴于別嘌呤醇和非布司他等藥物，這些藥物通過抑制黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）活性來減少UA生成。然而這些藥物可能伴隨一些不良反應，別嘌呤醇常導致嚴重的過敏反應，如皮疹、瘙癢性丘疹、蕁麻疹和水皰性反應等；非布司他常導致肝功能異常，如肝功能衰竭和黃疸等[4]。因此，從天然產物中尋找新的替代或補充治療藥物及其前體化合物十分必要。黃酮是一類廣泛存在于植物中的多酚類化合物，因其具有多種生物活性而備受關注。其中，黃酮類化合物在降低UA水平方面的潛力近年來引起了大量研究者的興趣。已有研究表明，一些黃酮類化合物可通過調節UA在腎臟的重吸收或抑制XO的活性發揮降UA作用[5]。已有研究表明艾葉提取物可降低高尿酸血癥小鼠UA水平[6]，但發揮藥效的活性成分未見報道。
? ? ? ? 本研究通過斑馬魚實驗、分子對接和體外酶學實驗等探究艾葉醇提物的降UA作用及發揮藥效的活性成分，旨在找到其發揮降UA作用的化學成分，為開發不良反應更小的降UA天然藥物提供實驗依據。
1?材料
1.1? 動物
? ? ? ? AB品系野生型斑馬魚由國家水生物種資源庫國家斑馬魚中心提供，養殖于本實驗室循環養殖系統，環境溫度28 ℃，養殖用水pH 7.4，晝夜交替周期為14 h/10 h。
1.2? 藥品與試劑
? ? ? ? 艾葉購于李時珍醫藥集團有限公司，經湖北中醫藥大學陳林霖研究員鑒定為菊科植物艾Artemisia argyi Lévl. et Vant.的干燥葉。金合歡素（批號PS011043，質量分數＞98%）、澤蘭黃酮（批號PS011078，質量分數＞95%）購于成都普思生物科技股份有限公司；槲皮素（批號100081-200907，質量分數98%）購于中國食品藥品檢定研究院；山柰酚（批號H1817030，質量分數97%）、芹菜素（批號L1927042，質量分數≥98%）、木犀草素（批號L1807023，質量分數≥98%）、氧嗪酸鉀（批號K2228489，質量分數≥98.0%）、別嘌醇（批號C2215368，質量分數98%）、黃嘌呤（批號L2107070，質量分數98%）、UA（批號L2215157，質量分數99%）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；黃嘌呤氧化酶（批號C14951018）購于上海麥克林生化科技有限公司；總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒（批號091323240207）、活性氧檢測試劑盒（批號080923240115）及脂質氧化丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號090423231215）購于碧云天生物技術有限公司； XO比色法測試盒（批號WA238VV09710）購于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。
1.3?儀器
? ? ? ? Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀、柱溫箱、DAD檢測器及變色龍色譜在線分析軟件 [賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；CNW Athena C18-WP色譜柱（上海安譜實驗科技股份有限公司）；WD-9415B型超聲清洗器（北京市六一儀器廠）；AB135-S型電子分析天平（瑞士梅特勒托利多儀器公司）；PURELAB Ulitra超純水系統 [威立雅（中國）環境服務有限公司]；KZ-II型高速組織研磨儀（武漢塞維爾生物科技有限公司）；N60 Implen型紫外分光光度計（北京諾匯誠科技有限公司）。
2? 方法
2.1? 艾葉醇提物的制備及總黃酮含量測定
2.1.1? 艾葉醇提物的制備?艾葉粉碎后過2號篩，取10 g艾葉粉末，加100 mL體積分數80%乙醇回流提取1 h，靜置至室溫后濾出醇提液，再次加入100 mL體積分數80%乙醇回流提取1 h，濾過后合并濾液，將濾液濃縮至10 mL，即得到質量濃度為1 g/mL的艾葉醇提物。
2.1.2?總黃酮含量測定? 參考文獻方法[7]使用《中國藥典》2020年版鋁鹽顯色法測定艾葉醇提物中總黃酮含量。
2.2? 艾葉醇提物對斑馬魚的作用研究
2.2.1? 斑馬魚最大耐受濃度（maximum talerated concentration，MTC）的測定? 隨機選取90尾受精后5 d（5 day post fertilization，5 dpf）的野生型AB品系斑馬魚，將斑馬魚轉入24孔板中，15尾/孔。用養魚用水配制質量濃度分別為250、500、1 000、2 000、4 000 μg/mL（以艾葉生藥量計，下同）的艾葉醇提物溶液，除對照組外其余各孔分別加入艾葉醇提物2 mL，對照組加入2 mL養魚用水，28 ℃處理3 d，根據斑馬魚狀態及死亡率確定MTC。
2.2.2? 斑馬魚的分組、造模及給藥 ?5 dpf野生型AB品系斑馬魚隨機分為對照組、模型組、陽性藥（136 μg/mL）組及艾葉低、中、高（250、500、1 000 μg/mL）劑量組。除對照組外，其余各組均使用含250 μmol/L氧嗪酸鉀和10 μmol/L黃嘌呤的養魚水進行造模。陽性藥組在養魚水中給予別嘌呤醇，艾葉低、中、高劑量組分別在養魚水中給予相應艾葉醇提物，對照組給予等量養魚用水[8-9]。24 h后收集各組斑馬魚于EP管中，加PBS清洗3遍，吸干PBS后稱定質量并將斑馬魚保存于?80 ℃備用。
2.2.3?HPLC檢測斑馬魚UA水平?每組取適量斑馬魚并稱定質量，加入200 μL PBS后經組織研磨儀勻漿，15 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清，測定UA水平。色譜條件參考文獻方法[10]并稍作優化，使用Athena C18-WP色譜柱（250 mm×4.9 mm，5 μm），流動相為pH 2.5乙酸水（A）-5%甲醇（B）；0～12 min，5% B；進樣體積20 μL；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長294 nm。采用PBS配制UA質量濃度分別為5、10、15、20、25 μg/mL的系列對照品溶液。在上述色譜條件下進樣，以樣品質量濃度（p）為橫坐標、色譜峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線A＝1.530 5 p＋0.938 9（r＝0.999 8）。以樣品峰面積計算UA濃度，并計斑馬魚體內UA水平。
斑馬魚體內UA水平＝(UA濃度×PBS體積)/(斑馬魚質量)
2.2.4?斑馬魚氧化應激水平的測定? 按照“2.2.2”項方法處理斑馬魚，按照試劑盒說明書測定各組斑馬魚MDA、ROS水平及SOD活性。
2.2.5? 斑馬魚XO活性的測定? 按照“2.2.2”項方法處理斑馬魚，按照試劑盒說明書測定各組斑馬魚體內XO活性。
2.3? 艾葉黃酮與XO的分子對接
? ? ? ? XO的X-ray晶體三維結構文件來源于RCSB蛋白數據庫[11]。該結構包含6個配體，其中FAD和MOS為XO催化黃嘌呤羥基化必要配體[12]，保留這些配體并刪除其余配體，去掉靶蛋白的水分子并進行加氫、加電荷和計算電荷。通過TCMSP數據庫和文獻[13]檢索收集艾葉中存在的黃酮類成分，用swissADME數據庫預測所有化合物的ADME性質，根據Lipinski類藥性五原則篩選出33種候選黃酮，在pubchem中下載黃酮類成分結構。選擇MO和FAD 2個位點進行分子對接[11]。其中MO中心對接盒子的中心坐標為21.229、13.900、117.409，盒子的大小為40×40×40個網格點，每個網格點大小為0.037 5 nm。FAD中心對接盒子的中心坐標為31.449、53.456、99.022，盒子的大小為40×58×40個網格點，每個網格點大小為0.508 nm。設置參數后運行vina進行半柔性對接。
2.4?艾葉黃酮對XO抑制率的測定
2.4.1? 酶促反應體系的建立?反應體系以黃嘌呤為底物，在適宜條件下XO可將黃嘌呤催化為UA，加入各黃酮類成分后反應一定時間，以反應終止時體系中黃嘌呤的濃度計算相應黃酮的XO抑制率。根據預實驗確定酶促反應體系中XO終濃度為5 U/L，底物黃嘌呤終濃度為0.40 mmol/L，黃酮類成分濃度分別為0.05、0.10、0.20 mmol/L，反應溫度為37 ℃，反應時間為60 min。
2.4.2? 色譜條件及標準曲線的建立? 參考文獻方法[14]稍作優化，使用Athena C18-WP色譜柱（250 mm×4.9 mm，5 μm）；流動相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（A）-5%甲醇（B）；0～18 min，5% B；進樣體積20 μL；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm。采用PBS配制黃嘌呤濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L的系列對照品溶液。在上述色譜條件下進樣，以p為橫坐標、A為縱坐標繪制標準曲線，得到的標準曲線為A＝167.42 p＋0.452 6（r＝0.999 8）。
2.4.3?艾葉黃酮對XO抑制率的測定? 取100 μL 50 U/L的XO溶液于24孔板中，各給藥組分別加入50、100、200 μL的別嘌呤醇、木犀草素、金合歡素、槲皮素、山柰酚、澤蘭黃酮和芹菜素（1 mmol/L）的對照品溶液，對照組加入等體積PBS，37 ℃孵育15 min。加入400 μL的黃嘌呤溶液（1 mmol/L）啟動反應，37 ℃孵育60 min后，加入500 μL HCl（1 mol/L）終止反應。將反應溶液定容至2 mL，進樣檢測黃嘌呤濃度，計算XO抑制率。
2.5? 統計學分析
利用GraphPad prism 10.0軟件進行統計學分析，數據以表示，組間比較采用單因素方差分析。
3?結果
3.1?艾葉醇提物總黃酮含量測定
艾葉醇提物中總黃酮質量濃度為18.4 mg/mL。
3.2? 艾葉醇提物對斑馬魚的作用研究
3.2.1? 斑馬魚的MTC? 斑馬魚經250、500、1 000、2 000、4 000 μg/mL艾葉醇提物藥浴處理3 d后，艾葉醇提物各劑量組死亡率依次為0、0、0、53.3%和93.3%。因此，斑馬魚的MTC為1 000 μg/mL，選擇250、500、1 000 μg/mL劑量作為低、中、高劑量。
3.2.2? 對斑馬魚UA水平的影響? 如圖1所示，與對照組比較，模型組UA水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥組及艾葉醇提物中、高劑量組UA水平顯著降低（P＜0.05、0.01），提示艾葉醇提物能顯著降低高尿酸血癥斑馬魚體內的UA水平。
3.2.3?斑馬魚氧化應激水平的測定? 如圖2所示，與對照組比較，模型組斑馬魚MDA水平顯著升高（P＜0.001），SOD活力顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，艾葉醇提物低、中、高劑量組MDA水平顯著降低（P＜0.001），SOD活力顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。如圖3所示，與對照組比較，模型組斑馬魚ROS水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，艾葉醇提物低、中、高劑量組ROS水平顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001）。結果表明，艾葉醇提物能夠促進高尿酸血癥斑馬魚的氧化還原平衡，改善斑馬魚機體的氧化應激狀態。其原因可能是模型組斑馬魚由于UA水平升高而使氧化應激反應加劇[15]，經艾葉醇提物處理后，斑馬魚UA水平降低，從而改善了氧化應激狀態。
3.2.4 ?斑馬魚XO活性的測定?如圖4所示，與對照組比較，艾葉低、中、高劑量組斑馬魚XO活性均顯著降低（P＜0.01），推測艾葉醇提物可能通過抑制斑馬魚XO活性，從而抑制UA的生成。
3.3?分子對接
3.3.1? 準確性驗證?使用pymol軟件將XO中的原始配體FAD提取出來，根據“2.3”項下方法將FAD與去除FAD的XO進行分子對接，結果見圖5。用pymol計算對接后的配體分子與原配體分子的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）＝0.845。用同樣方法將水楊酸與XO的MO中心進行對接，對接后的配體分子與原配體分子的RMSD＝0.000，表明該方法參數設置合理，程序適用，可用于后續黃酮類化合物的分子對接。
3.3.2? 艾葉黃酮與XO的分子對接?艾葉黃酮與XO的FAD和MO中心對接的最低結合能、關鍵氫鍵和π-π相互作用見表1。在XO的MO中心，ARG-880、GLU-802、PHE-914和PHE-1009是XO催化黃嘌呤生成UA過程中的關鍵氨基酸。艾葉黃酮化學成分，如木犀草素、槲皮素、山柰酚、澤蘭黃酮、棕矢車菊素、異澤蘭黃素、茵陳色原酮、高車前素、6-甲基苜蓿素和芹菜素等均能與這些關鍵氨基酸結合，這說明以上化學成分可能競爭黃嘌呤與XO的結合位點來抑制XO的催化反應。FAD主要負責黃嘌呤羥基化反應的電子轉移，分子對接研究發現牡荊素、圣草酚、木犀草素、6-甲基苜蓿素、棕矢車菊素、異澤蘭黃素、矢車菊黃素和蔓荊子黃素等黃酮能與FAD形成氫鍵，因此推測以上化學成分可能通過抑制UA生成反應的電子轉移過程來抑制UA生成。
? ? ? ? 根據結合能大小篩選出低于所有黃酮結合能均值的黃酮，再根據與關鍵氨基酸形成相互作用力的數量篩選出可能具有較強XO抑制活性的化合物。木犀草素、槲皮素、山柰酚、澤蘭黃酮、芹菜素和金合歡素在MO中心和FAD中心的結合能均低于其他化學成分，且能與XO形成至少3個及以上的關鍵作用力。推測木犀草素、槲皮素、山柰酚、澤蘭黃酮、芹菜素和金合歡素具有較好的抑制XO活性，各化學成分與XO的MO中心結合模式見圖6。
3.4? 艾葉黃酮對XO抑制率的測定
? ? ? ? 如圖7所示，在相同濃度下木犀草素與陽性藥別嘌呤醇具有相近的XO抑制率，而槲皮素、山柰酚、澤蘭黃酮、芹菜素也具有抑制XO活性，且抑制作用呈濃度相關性。該實驗結果提示艾葉黃酮降UA作用的機制可能與抑制XO活性相關，而主要發揮XO抑制活性的黃酮類化學成分可能為木犀草素、槲皮素、山柰酚、澤蘭黃酮及芹菜素，而金合歡素對XO的抑制率較低且不呈劑量相關，其原因有待進一步探討。
4? 討論
? ? ? ? 本研究表明UA水平升高可能破壞氧化還原平衡，加劇氧化應激反應。艾葉醇提物可以降低UA生成，同時改善機體氧化應激狀態，該結果與研究報道結果一致[6]。本研究在明確藥效的基礎上，開展了艾葉醇提物降UA的機制研究。通過測定各組斑馬魚XO活性發現艾葉醇提物可能通過抑制XO活性達到降UA作用。研究發現，多種植物中的黃酮類化合物均有抑制XO活性的作用[5]，因此，利用分子對接技術模擬了艾葉中各黃酮與XO的結合情況。分子對接結果解釋了艾葉醇提物發揮降UA作用的機制。XO中有2個 [2Fe-2S] 簇中心、1個FAD中心和1個MO中心，其中MO中心負責與黃嘌呤結合并發生羥基化反應，[2Fe-2S] 簇中心和FAD中心負責反應后的電子轉移。在MO中心，ARG-880和GLU-802能夠穩定反應中間體；PHE-914和PHE-1009形成夾心狀占據底物黃嘌呤的芳香環，并通過強烈的π-π堆積作用穩定黃嘌呤，其對黃嘌呤與XO的識別有關鍵作用[16-18]。FAD主要負責黃嘌呤羥基化反應后的電子轉移，黃嘌呤在MO中心被轉化為UA后將產生1個電子，該電子經 [2Fe-2S] 轉移至FAD中心，并經FAD轉移至超氧陰離子及過氧化氫中，若黃酮占據FAD中心，則可能影響黃嘌呤羥基化反應后的電子轉移及超氧陰離子和過氧化氫的生成，進而阻斷UA的生成反應[19]。根據各黃酮在XO的MO和FAD 2個關鍵活性位點的結合能及與關鍵氨基酸形成作用力的數量，從33種黃酮中篩選出可能具有較高抑制活性的黃酮，并通過體外實驗了進一步驗證了分子對接的結論。結果發現，木犀草素、槲皮素、山柰酚、澤蘭黃酮、芹菜素均能抑制XO的活性，且具有劑量相關性。其中，木犀草素的抑制率接近同等濃度的別嘌呤醇，這與研究報道結果相似[20]。
綜上，本研究通過動物實驗證明了艾葉醇提物具有降UA作用，通過分子對接及XO抑制率實驗發現發揮降UA作用的主要成分為黃酮類化合物。分子對接研究發現艾葉中黃酮類化合物可能通過競爭黃嘌呤結合位點或影響反應的電子轉移過程而抑制XO活性，進而影響UA的生物合成。通過體外酶學實驗研究發現木犀草素、槲皮素、山柰酚、澤蘭黃酮、芹菜素在一定濃度下均能抑制XO活性，推斷其可能為發揮降UA作用的關鍵化學成分。本研究系統闡述了艾葉醇提物的降UA作用、機制及物質基礎，為研發降UA藥物提供實驗依據。
利益沖突?所有作者均聲明不存在利益沖突
