文章來源：半夏 藥靶孺子牛
值得注意的，今年 6月，復旦大學附屬中山醫院湯其群教授團隊在Science（IF=56.9）也發表過一篇青蒿素及其衍生物的文章“Artemisinins ameliorate polycystic ovarian syndrome by mediating LONP1-CYP11A1 interaction”，發現青蒿素類衍生物能夠顯著改善PCOS的疾病表型。機制上，青蒿素能夠靶向線粒體蛋白酶LONP1，促進LONP1與其底物CYP11A1的結合，加速CYP11A1的降解，抑制卵巢雄激素的合成，降低PCOS患者的雄激素水平，改善月經周期及卵巢多囊樣變。該研究證明青蒿素還可以緩解多種嚙齒動物模型和人類患者中多囊卵巢綜合征的內分泌表現。感興趣的朋友可一起關注一下。
2024年10月16日，斯坦福大學科學團隊在Cell（IF=45.5）發表了題為“Multiscale drug screening for cardiac fibrosis identifies MD2 as a therapeutic target”的文章，開發了新的高通量多維度藥物篩選技術，從約5000個化合物中找到了治療心臟纖維化的破局新藥—青蒿琥酯（Artesunate，ART）。機制上，青蒿琥酯以MD2為靶點，能夠有效抑制心臟成纖維細胞中的纖維化基因表達，抑制其增殖、遷移和收縮，減少膠原蛋白沉積，改善心衰小鼠心臟功能。
1、多尺度藥物篩選鑒定抗纖維化化合物
作者首先建立了一個人誘導多能干細胞（iPSC）為基礎的多尺度藥物發現平臺，從iPSC中獲得對纖維化刺激敏感的iPSC-CF，以ACTA2為標志檢測MyoFB的激活。通過對約5000個化合物進行了2次獨立的高通量篩選，每個化合物測試7個不同劑量，并隨后對iPSC衍生的心肌細胞（CM）和內皮細胞（EC）進行反篩選，排除具有潛在心血管毒性的化合物。
通過上述HTS和反篩選，青蒿琥酯（ART）成為了首選候選藥物，EC50為2.1 mM，對ipsccm或iPSC-ECs無毒性達10 mM。隨后作者驗證了其在人原發性CFs中的抗纖維化作用，ART治療抑制了TGF-b1刺激下ACTA2和COL1A1的表達。此外，毒性測試顯示ART并沒有顯著損害原代CFs的活力、iPSC-CMs的活力和收縮力，以及原代ECs的活力和一氧化氮的產生。這些結果共同證明了ART治療心臟纖維化的潛在療效和安全性（圖1）。
圖1 多尺度藥物篩選鑒定抗纖維化化合物
2、ART抑制CFs和3d – EHT中MyoFB的激活
然后，作者進行了一系列功能研究，以全面評估抗ART治療的抗纖維化作用。在多種促纖維化因子（血管緊張素II、結締組織生長因子、白細胞介素11、血小板衍生生長因子bb、TGF-b1、tenascin-C和內皮素-1）誘導的iPSC-CF模型和心臟纖維化患者體內分離的MyoFB中，青蒿琥酯都能有效地抑制MyoFB增殖和膠原分泌。此外，青蒿琥酯同時具有預防和治療效果。總的來說，結果表明ART抑制iPSC-CFs、人原發CFs、人患病心肌病MyoFBs和3D eht的纖維化（圖2）。
圖2?青蒿琥酯抑制心肌成纖維細胞和工程心臟組織的肌成纖維細胞活化
3、在心衰和心肌梗死的臨床前小鼠模型中，ART可減輕纖維化并改善心功能
接著，研究利用采用小鼠主動脈縮窄術（TAC）用以模擬心臟肥厚早期階段的纖維化，發現青蒿琥酯治療可顯著減少心肌中的膠原沉積和MyoFB標記基因表達，青改善了TAC導致的心衰相關心臟功能障礙。此外，在缺血再灌注（IR）模擬心肌梗死的小鼠模型中，青蒿琥酯同樣能顯著改善心功能（圖3）。
圖3 在心力衰竭小鼠模型中，青蒿琥酯可減輕纖維化并改善心功能
4、ART抑制TAC誘導的成纖維細胞群體的動態轉化
為了揭示TAC模型中ART治療后CF轉分化的動態，作者使用103xGenomics平臺對3個實驗組進行了單核RNA測序（snRNA-seq）： sham， TAC組（TAC）和TAC+ART處理組。snRNA-seq的無監督聚類鑒定出多個心臟細胞簇，包括CFs、CMs、ECs、巨噬細胞和周細胞。成纖維細胞簇的差異表達基因（DEG）分析顯示，有161個tac上調基因被ART顯著抑制，如Col1a1、Col1a2、Col3a1、Postn、Eln、Sparc、Fbn1和Loxl1。GO和KEGG通路分析表明，這些基因主要參與纖維化的發展，如TGF-b信號傳導、ECM組織、膠原形成和膜-ECM相互作用（圖4）。
圖4 青蒿琥酯抑制TAC誘導的成纖維細胞群體的動態變化
5、ART可抑制cf中的纖維化基因和通路
接下來，作者研究了在CFs中ART調控的細胞信號。在TGF-b1或IL-11刺激下，ART以劑量依賴性的方式抑制健康供體人原代CFs中的關鍵MyoFB標記物和ecm，包括ACTA2、COL1A1、POSTN、纖維連接蛋白（FN1）和CTGF。ART也抑制了人患病心肌病myofb中這些纖維化基因的表達。為了全面描述轉錄組學變化，作者對6個獨立品系中經載體和art處理的人原代CFs進行了RNA測序，這些CFs有或沒有TGF-b1刺激。在所有TGF-b1刺激的基因中，有459個基因被ART顯著逆轉，包括ACTA2、COL1A1、COL1A2、TAGLN、SPARC、LOX、CDK1、E2F1和PLK1。GO和GSEA途徑分析顯示，ART下調了信號級聯反應，包括ECM組織、膠原形成、增殖和遷移、平滑肌收縮和結締組織發育。
此外，作者還評估了ART對其他器官成纖維細胞的抗纖維化作用，觀察到ART抑制了從特發性肺纖維化（IPF）肺組織、瘢痕疙瘩皮膚組織和代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH）患者肝組織中分離的活化的人患病myofb中ACTA2和COL1A1的表達。這些結果表明，在外界促纖維化刺激下，ART可減弱人原代CFs中纖維化基因的表達和信號通路，并減輕各種纖維化疾病中來自不同器官的人患病myofb的激活（圖5）。
圖5 青蒿琥酯抑制纖維化基因和途徑
6、ART通過分子靶向MD2抑制MyoFB的激活
ART通過結合紅細胞中的血紅素產生活性氧（ROS），是治療瘧疾最有效的療法之一。作者注意到血紅素相關基因，包括HBA1、HBA2和HBB，在人類原發性CFs中不表達，這表明抗纖維化和抗瘧疾作用之間存在不同的機制。據報道，ART可抑制巨噬細胞中的toll樣受體4 （TLR4）信號傳導，然而，TLR4信號在cf中的作用以及ART如何調節TLR4通路尚不清楚。MD2是與TLR4相互作用的共受體，在配體如脂多糖（LPS）的刺激下形成信號受體。
作者觀察到LPS刺激了人原代CFs中纖維化基因（ACTA2, COL1A1， CTGF）的表達，表明MD2/TLR4的激活促進了MyoFB的激活。為了評估MD2和TLR4在心臟纖維化中的作用，作者用siRNA沉默MD2或TLR4的表達，發現MD2或TLR4敲低均可通過TGF-b1刺激抑制人原發CFs的轉分化，并減弱人患病心肌病MyoFBs的激活。作者還測試了先前確定的已知抑制MD2/TLR4信號通路的化合物，包括TLR4抑制劑T5342126和TAK-242，以及MD2抑制劑L6H21。與基因敲低實驗一致，這三種化合物都抑制MyoFB的激活，突出了通過藥理調節MD2/TLR4信號通路的抗纖維化作用。
然后，作者檢查了ART是否直接與MD2結合，通過表面等離子體共振（SPR）發現ART與MD2之間的結合，通過分子動力學模擬進一步研究了相互作用，發現ART誘導的MD2構象變化。ART穩定了MD2中殘基80-88的結構域，這需要MD2-TLR4結合的靈活性。因此，穩定該結構域會拮抗MD2-TLR4相互作用，從而抑制信號通路。進一步作者通過Trp熒光測定證明ART在功能上誘導了MD2的構象變化。
接著評估ART干擾LPS-MD2結合的能力，ART和L6H21在MD2中LPS結合位點占據了相當大的空間，這表明ART和L6H21與LPS競爭性地結合MD2。
接著作者證實了ART對LPS MD2相互作用的競爭性拮抗作用，并發現ART以劑量依賴的方式取代生物素標記的LPS（生物素-LPS）與MD2結合，比L6H21更有效，這意味著ART具有更強的抗纖維化活性。同樣，在TGFb1刺激的人原代CFs中，ART比L6H21更有效地抑制關鍵纖維化基因（ACTA2、COL1A1、CTGF）的表達。總的來說，這些結果表明ART通過靶向MD2抑制MyoFB的激活（圖6）。
圖6 MD2被確定為青蒿素的分子靶點
7、青蒿琥酯可拮抗MD2-TLR4信號級聯
MD2是與TLR4相互作用的共受體，在配體刺激下形成信號受體。除了來自革蘭氏陰性菌的LPS外，損傷相關分子模式（DAMPs）也可以刺激MD2/TLR4信號通路。特別是，ECM成分，如TNC和FN1，先前被確定為能夠激活MD2/TLR4。作者觀察到TNC和FN1在TGF-b1刺激的人原發CFs中上調和患病心肌病MyoFBs。重組TNC蛋白刺激了人原代CFs中纖維化基因的表達，ART抑制了纖維化基因的表達。
接下來，作者驗證了ART抑制配體誘導的MD2-TLR4復合物形成的假設。采用PLA和coIP來檢測過表達MD2/TLR4的HEK細胞和人原代CFs之間的生物化學相互作用，發現ART顯著抑制了MD2-TLR4的相互作用。
ERK是MD2/TLR4的主要下游信號通路之一，被報道為纖維化調控的重要模塊，作者發現ART抑制ERK活性。為了確定轉錄因子（TFs）通過MD2/TLR4信號控制由ART調節的纖維化基因表達，作者接下來在TGF-b1刺激后，在載體和ART處理的人原發CFs中進行ATAC-seq測定，發現ART降低了tgf -b1誘導的染色質可及性。ATAC-seq顯示ART抑制tgf -b1誘導的與纖維化高度相關的通路，包括ECM組織、傷口愈合和細胞骨架。
MAPK信號也被確定為下調的最高途徑之一，與ART通過MD2/TLR4途徑觀察到的ERK抑制（即MAPK家族）一致。此外，無監督的基序富集分析顯示，激活蛋白-1 (AP1) TF家族是在TGF-b1刺激下ART下調最多的基序。作者驗證了AP1家族的主要成分之一c-FOS 75在tgf -b1刺激的人原發CFs中被ART抑制。tac誘導的HF小鼠模型心臟組織中的ERK和c-FOS信號也被ART減弱。總之，研究結果表明，ART通過分子靶向MD2，抑制MD2和TLR4的相互作用，從而減弱細胞質中的ERK和細胞核中的c-FOS，從而減少cf中纖維化基因的表達（圖7）。
圖7 青蒿琥酯可拮抗MD2-TLR4信號級聯
總結
圖8?青蒿琥酯靶向MD2蛋白治療心臟纖維化
