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葛根作為藥食同源的傳統(tǒng)中藥代表，在臨床上已經(jīng)有千余年的使用歷史。葛根及其制劑對于心血管和代謝性疾病有著良好的療效和安全性，但是其作用方式尚不清楚。（我們前期分享了多篇葛根素作用文章：GUT | 葛根素通過調(diào)節(jié)腸道微生物減輕動脈粥樣硬化；Adv Sci | 葛根素增強SIRT5去琥珀酰化酶活性緩解急性肝損傷（靶點機制+藥物篩選）；Phytomedicine | 葛根素通過拮抗TLR4/myd88，抑制巨噬細胞M1型極化，減輕腎臟炎癥損傷；J. Agric. Food Chem | 葛根素通過調(diào)節(jié)腸道菌群和抑制p38MAPK信號通路延緩乳腺衰老；J Agric Food Chem | 葛根素通過激活自噬誘導(dǎo)巨噬細胞M2極化發(fā)揮抗酒精性脂肪性肝炎活性）。
這項工作使用前沿技術(shù)發(fā)現(xiàn)了葛根主要活性成分葛根素的分子靶點并闡明了其全新的作用機制，未來該成果的臨床推廣與應(yīng)用有望為代謝性疾病患者帶來福音；并且，對探索其他中藥活性成分的藥理作用具有示范標(biāo)桿效應(yīng)。未來，靶向DMV核團神經(jīng)元以及GABAAR和微絨毛調(diào)控關(guān)鍵基因等，有望開發(fā)新型的減重藥物。
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摘要
雖然脂肪是飲食中重要的能量來源，但攝入過多會導(dǎo)致肥胖。目前普遍認(rèn)為，腸道內(nèi)的脂肪吸收是通過擴散的方式實現(xiàn)器官自主吸收。然而，這一過程是否由腦-腸軸控制，目前仍不清楚。本研究證明了迷走神經(jīng)背側(cè)運動核(DMV)在這一過程中起著關(guān)鍵作用。DMV神經(jīng)元的失活會減少腸道脂肪吸收，從而導(dǎo)致體重減輕，而DMV的激活會增加脂肪吸收和體重增加。值得注意的是，投射到空腸的DMV神經(jīng)元亞群的失活縮短了微絨毛的長度，從而減少了脂肪的吸收。此外，發(fā)現(xiàn)了一種天然化合物葛根素，它可以模擬對dmv -迷走神經(jīng)通路的抑制，從而減少脂肪吸收。GABAA受體-葛根素復(fù)合物的結(jié)構(gòu)的光親和性化學(xué)方法和低溫電子顯微鏡揭示葛根素結(jié)合到一個變構(gòu)調(diào)節(jié)位點。值得注意的是，DMV中條件敲除Gabra1在很大程度上消除了葛根素誘導(dǎo)的腸道脂肪丟失。綜上所述，發(fā)現(xiàn)抑制dmv-迷走神經(jīng)-空腸軸通過縮短微絨毛的長度來控制腸道脂肪吸收，并闡明了葛根素結(jié)合GABRA1在減脂中的治療潛力。
1.DMV調(diào)節(jié)空腸脂肪吸收
考慮到DMV在腦-腸通路中的核心作用，首先評估了DMV神經(jīng)元失活對腸道脂肪吸收的影響。使用專門由設(shè)計藥物激活的化學(xué)遺傳設(shè)計受體(DREADDS)技術(shù)，并將表達cre依賴性hM4D(Gi)的重組腺相關(guān)病毒(rAAV- ef1 α- dio -hM4D(Gi)-mCherry)或?qū)φ誂AV (rAAV- ef1 α- dio -mCherry)雙側(cè)注射到Phox2b-cre雜合子小鼠的DMV區(qū)域。這種方法能夠特異性靶向DMV中的PHOX2B神經(jīng)元群(圖1a-c)。腹腔內(nèi)注射后注射CNO后，DMV神經(jīng)元被抑制的小鼠(Px2b-4i)與對照組小鼠(Px2b-con)相比，體重增加較少(圖1d)。通過口服脂肪耐量試驗(OFTT)比較各組腸道甘油三酯(TG)吸收情況。Px2b-4i小鼠在油灌胃后顯示比Px2b-con小鼠更低的血漿TG水平(圖1e)。從Px2b-4i小鼠收集的糞便中，非酯化脂肪酸(NEFA)和TG(圖1f,g)的含量顯著高于對照小鼠的糞便，這表明DMV抑制后脂肪排泄增加。同樣，觀察到Px2b-4i小鼠的空腸脂肪吸收減少(圖1h)，這是負責(zé)脂肪吸收的主要部位。這些發(fā)現(xiàn)表明，DMV抑制導(dǎo)致空腸脂肪吸收減少。
為了證實上述腸道表型主要是由DMV神經(jīng)元而不是其他phox2b表達神經(jīng)元(如NTS中的神經(jīng)元)的失活導(dǎo)致的，進一步在Chat-cre小鼠中對DMV神經(jīng)元進行了化學(xué)遺傳失活。在這些小鼠中，Cre重組酶選擇性地在膽堿能(CHAT+)神經(jīng)元中表達，這些神經(jīng)元主要位于DMV，而不在nts(圖1i)。將cre依賴性AAV-hM4D(Gi)注射到Chat-cre小鼠的DMV中(圖1j)。在添加CNO后，觀察到Chat-4i小鼠與Chat-con小鼠相比，體重增加更少，血漿TG水平更低，糞便脂肪排泄更多，空腸脂肪吸收更少(圖1k-o)。這些結(jié)果與Px2b-4i小鼠的表型一致，并驗證了DMV抑制對空腸脂肪吸收的抑制作用。
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圖1:DMV控制空腸脂肪吸收和體重增加
2.葛根素抑制DMV的鑒定
為了識別調(diào)節(jié)DMV神經(jīng)元的化學(xué)分子或天然化合物，將藥物治療和電生理相結(jié)合，對PHOX2B-Cre:Rosa26-tdTomato小鼠的腦干切片進行了研究。葛根素是一種被批準(zhǔn)用于治療心腦血管疾病的藥物，葛根素的Bath應(yīng)用導(dǎo)致動作電位頻率顯著降低(圖2a,b)，這是由于DMV神經(jīng)元的膜電位超極化(圖2c)。在總共22個檢測到的神經(jīng)元中，16個(72.7%)顯示了葛根素抑制的放電變化模式(圖2d)。在腹腔注射葛根素后喂養(yǎng)高脂飲食的小鼠中，與對照組小鼠相比，DMV中fos陽性神經(jīng)元的數(shù)量顯著減少(圖2e,f)。還觀察到葛根素(腹腔)治療在不影響攝食的情況下減少了體重增加(圖2g,h)，降低了血漿TG水平(基于OFTT;圖2i)，增加糞便脂肪排泄(圖2j,k)和抑制空腸脂肪吸收(圖2l)。為了避免葛根素對周圍器官的潛在混雜作用，配對喂養(yǎng)的高脂飲食小鼠側(cè)腦室注射葛根素(圖2m)。葛根素治療持續(xù)抑制體重增加和降低血漿TG水平(圖2n,o)。值得注意的是，還觀察到葛根素的中央給藥增加了糞便總脂質(zhì)含量(圖2p,q)和減少了空腸TG含量(圖2r)。綜上所述，這些結(jié)果表明葛根素具有抑制DMV活性的作用，從而導(dǎo)致空腸脂肪吸收的減少。
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圖2:葛根素抑制DMV活性，導(dǎo)致空腸脂肪吸收減少
3.?葛根素靶向GABRA1抑制DMV
為了闡明介導(dǎo)DMV神經(jīng)元對脂肪吸收的抑制作用的分子機制，接下來使用葛根素作為誘餌，進行了基于活性的蛋白質(zhì)譜分析策略。葛根素標(biāo)簽探針與光反應(yīng)標(biāo)簽合成，通過光親和化學(xué)反應(yīng)富集和可視化目標(biāo)蛋白(圖3a)。驗證了探針標(biāo)記的葛根素與未標(biāo)記的葛根素保持相同的增加糞便脂質(zhì)排泄的效果。將探針標(biāo)記的葛根素添加到新鮮分離的腦干樣本中，并使用10劑未標(biāo)記的葛根素作為探針標(biāo)記的葛根素的競爭劑(方法)。光親和反應(yīng)后，通過液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS /MS)鑒定目標(biāo)蛋白。在571個潛在的靶蛋白中(圖3b)，只有14個候選蛋白屬于膜受體和離子通道。在這14種蛋白質(zhì)中，GABRA1被優(yōu)先考慮為有前景的靶點，因為它在DMV中大量表達，而在鄰近腦區(qū)中表達較少(Allen brain Map數(shù)據(jù)庫)。此外，GABAA受體與迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)有關(guān)。通過蛋白質(zhì)印跡法驗證了探針標(biāo)記的葛根素和GABRA1蛋白之間的相互作用(圖3c)。還檢測到探針標(biāo)記的葛根素與DMV區(qū)域PHOX2B-tdTomato神經(jīng)元中的GABRA1高度共定位，并且這些信號可以被10個劑量的非標(biāo)記的葛根素阻斷(圖3d)。
GABAA受體是五聚體配體門控離子通道，是脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)中抑制性神經(jīng)傳遞的主要決定因素。為了研究葛根素對含α1亞基的GABAA受體的作用，使用了α1β3γ2L異五聚體，一個典型的神經(jīng)元亞型。首先，通過全細胞膜片鉗記錄表達該受體的HEK293S細胞，發(fā)現(xiàn)葛根素放大了gaba誘導(dǎo)電流(圖3e,f)。接下來，我們解決了與葛根素結(jié)合的α1β3γ2L GABAA受體的單粒子低溫電子顯微鏡(cryo-EM)結(jié)構(gòu)，名義分辨率為2.4 ?(圖3 g)。葛根素密度在α1+/γ2 -界面的C環(huán)下觀察到(圖3 g),一個經(jīng)典的結(jié)合位點對苯二氮卓類和其他細胞外區(qū)域的變構(gòu)調(diào)節(jié)器對GABAA receptors突觸。在這個口袋里，葛根素的表面積為587 ?2。其羥基苯基指向γ2-C -亞基，色酮和葡萄糖苷主要與α1-D+-亞基結(jié)合。α1Tyr210和γ2Phe77殘基通過π -π疊加作用錨定葛根素色酮核心。除了水介導(dǎo)的接觸外，葛根素結(jié)合還通過一個氫鍵網(wǎng)絡(luò)來穩(wěn)定，該網(wǎng)絡(luò)涉及環(huán)C殘基α1Ser205和α1Thr207，以及α1His102和γ2Asp56(圖3h）。這些結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，連同電生理記錄，表明葛根素作為正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。
為了證實葛根素可以通過DMV GABRA1抑制脂肪吸收，將Gabra1flox/flox (Gabra1fl/fl)小鼠與Phox2b-cre小鼠雜交，產(chǎn)生GABRA1條件性敲除(cKO)小鼠。在沒有Gabra1的情況下，觀察到與對照flox小鼠相比，DMV神經(jīng)元活動增加，體重增加(圖3i,j)，糞便脂肪排泄減少(圖3k,l)和空腸脂肪吸收增加(圖3m)。值得注意的是，在對腦干切片進行全細胞膜片鉗記錄時，葛根素對對照組小鼠的大部分DMV神經(jīng)元(70%，14 / 20)產(chǎn)生抑制作用，但在沒有Gabra1的情況下，葛根素的作用大大降低(19.05%，4 / 21)。此外，Gabra1的缺失消除了葛根素抑制脂肪吸收和體重增加的作用(圖3i-m)。綜上所述，數(shù)據(jù)表明葛根素通過與含有α1亞基的GABAA受體結(jié)合，對dmv -迷走神經(jīng)軸發(fā)揮抑制作用，從而調(diào)節(jié)脂肪吸收。
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圖3:葛根素結(jié)合GABAA受體的α1亞基來調(diào)節(jié)DMV神經(jīng)元
4.空腸投射DMV神經(jīng)元在脂肪吸收中的作用
dmv-迷走神經(jīng)投射到胃腸道的不同節(jié)段。為了靶向投射到空腸的DMV神經(jīng)元，將編碼小麥-胚芽凝集素(WGA)和Cre重組酶融合蛋白的逆行AAV病毒(AAV- hsyn -WGA-Cre- p2a -mcherry (AAV-WGA-Cre))注射到野生型小鼠的空腸。同時，將cre依賴性hM4D(Gi)或?qū)φ誂AV病毒注射到DMV區(qū)域，從而實現(xiàn)對投射到WGA-hM4D(Gi) (WGA-4i)小鼠或?qū)φ?WGA-con)小鼠空腸的DMV神經(jīng)元的化學(xué)遺傳操作(圖4a,b)。與在Phox2b-cre和Chat-cre小鼠中DMV神經(jīng)元失活時觀察到的結(jié)果一致，觀察到WGA-4i小鼠的體重增加較少(圖4c,d)，血漿TG水平降低(圖4e)，糞便脂肪排泄增加(圖4f,g)和空腸脂肪吸收減少(圖4h)。這些結(jié)果表明，投射到空腸的DMV神經(jīng)元可以直接調(diào)節(jié)脂肪吸收和體重增加。
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圖4:空腸投射的DMV神經(jīng)元控制脂肪吸收和體重增加
5.DMV控制空腸微絨毛長度
接下來，探討了葛根素和dmv -迷走神經(jīng)軸如何影響脂肪吸收。首先檢測了dmv滅活小鼠空腸中脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白的表達，但未觀察到顯著變化。脂肪吸收效率被認(rèn)為與總表面積的變化密切相關(guān);然而，在滅活DMV神經(jīng)元或注射葛根素后，空腸上皮絨毛的長度沒有明顯變化。值得注意的是，使用基于EM圖像的分析，觀察到在DMV神經(jīng)元失活后，空腸微絨毛的長度減少(圖5a-c)。與此同時，調(diào)控微絨毛的基因，包括Ezr(編碼ezrin)、Cdc42、Eps8和Vil1，在dmv滅活小鼠中的表達水平顯著低于對照小鼠(圖5d)。此外，失活空腸投射DMV神經(jīng)元顯示出類似的結(jié)果，空腸微絨毛長度和相關(guān)基因表達減少(圖5e-h)。與DMV抑制的結(jié)果一致，葛根素(i.p)處理縮短了微絨毛的長度并降低了相關(guān)基因的表達，而在DMV中缺失Gabra1減弱了葛根素的這些作用(圖5i-m)。總之，這些觀察結(jié)果說明了一個模型，在這個模型中，DMV -迷走神經(jīng)通路通過影響空腸微絨毛長度來控制腸道脂肪吸收。
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圖5:抑制dmv -迷走神經(jīng)通路縮短空腸微絨毛以減少脂肪吸收
結(jié)論
在本研究中，確定了一條控制脂肪吸收的大腦（DMV）到腸道（空腸）通路。發(fā)現(xiàn) DMV 神經(jīng)元的失活會通過縮短微絨毛的長度來抑制空腸的脂肪吸收。此外，證明了臨床實踐中使用的天然化合物葛根素可以滅活 DMV 神經(jīng)元并通過 GABAA受體抑制脂肪吸收，從而揭示一種減少脂肪吸收的適用藥物。針對性控制DMV-迷走神經(jīng)通路來調(diào)節(jié)腸道脂肪吸收可能是治療肥胖和代謝疾病的潛在策略，為未來研究腦-腸控制營養(yǎng)吸收鋪平了道路。
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Lyu Q, Xue W, Liu R, Ma Q, Kasaragod VB, Sun S, Li Q, Chen Y, Yuan M, Yang Y, Zhang B, Nie A, Jia S, Shen C, Gao P, Rong W, Yu C, Bi Y, Zhang C, Nan F, Ning G, Rao Z, Yang X, Wang J, Wang W. A brain-to-gut signal controls intestinal fat absorption. Nature. 2024 Sep 11. doi: 10.1038/s41586-024-07929-5.?
文章來源：天然產(chǎn)物靶點發(fā)現(xiàn)
